Um salto de sensibilidade – comparação da detecção amperométrica e por índice de refração para análise de açúcares*

Juliane Böttcher, Mareike Margraf, Kate Monks, Mikhael Abe
KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Hegauer Weg 38, 14163 Berlin; www.knauer.net
METROHM BRASIL Rua Minerva, 161 – São Paulo; www.metrohm.com/pt-br

Introdução

Diversos métodos para análises de açúcares estão disponíveis usando diferentes colunas e detectores. Devido à ausência de grupos cromóforos, os carboidratos podem ser analisados através da detecção por índice de refração. Detectores de índice de refração (RID) são universais podendo ser aplicados para uma grande variedade de rotinas analíticas que vão além dos carboidratos como, por exemplo, a medição de ácidos orgânicos e álcoois. Eles são normalmente escolhidos por conta da robustez e facilidade de manuseio. Comparado com outros detectores eles são em muitos casos bastante econômicos. Sempre que o fator mais crítico de uma análise é a sensibilidade o detector RID precisa ter sua aplicabilidade avaliada para o atingimento dos limites necessários. Comparado com a detecção UV, por exemplo, o detector RID é capaz de medir apenas concentrações mais altas. Alternativas para detecção de substâncias sem grupos cromóforos são a detecção por espalhamento de luz (ELSD) ou a deteçcão amperométrica pulsada (PAD). A aplicação a seguir descreve as diferenças da detecção amperométrica e a detecção por índice de refração num sistema cromatográfico separando glicose, sacarose e arabinose. O foco das determinações foi definir os limites de detecção (LDs) dos métodos e compará-los destacando as vantagens e desvantagens de cada sistema.

Materiais e métodos

As determinações foram realizadas num cromatógrafo líquido modelo Knauer (Figura 1) com bomba gradiente AZURA P 6.1L, HPG operando em modo isocrático. Amostrador automático refrigerado AZURA AS 6.1L. Detectores RID e PAD modelos AZURA RID 2.1L e ECD 2.1. A separação foi realizada na coluna Eurokat Na de 300 mm de comprimento e 8 mm de diâmetro interno termostaizada em Termostato Azura CT 2.1. Os dados foram tratados utilizando o software ClarityChrom 8.1.

Figura 1: Cromatógrafo Líquido Knauer Azura

Resultados

Para a detecção amperométrica, o uso de hidróxido de sódio no eluente é necessário. Devido a isso, a separação foi realizada numa coluna Eurokat Sódio (Eurokat Na). Devido aos ligantes de sóio, esta coluna é adequada para condições de meio alcalino. Uma solução 0,015 mol/L de hidróxido de sódio foi usada como fase móvel para a detecção por RID e PAD. Os parâmetros detalhados do método estão descritos na seção de materiais e métodos. As colunas Eurokat Na são normalmente operadas em temperatura de 75 °C. Entretanto, a célula usada neste trabalho pode ser operada entre 10-40 °C. A grande diferença de temperatura causou um desvio na linha de base. Para estabilizar esta linha de base e minimizar o gradiente de temperatura, a coluna foi termostatizada a 60 °C. A Figura 2 (PAD) mostra as medições de um padrão mix de açúcares na concentração de 10 µg/mL para cada componente. A Figura 3 (RID) mostra o cromatograma da mesma mistura numa concentração de 1 mg/mL. Todos os analitos estão separados na linha de base.

Figura 2: Cromatograma de açúcares no detector PAD

Figura 3: Cromatograma de açúcares no detector RID

Baseado nestas leituras, o LD (Sinal/Ruído =3) foi determinado. Os resultados calculados e individuais de sinal e ruído estão resumidos na Tabela 1. O desempenho alcançado revela diferenças em sensibilidade. Enquanto as quantidades do LD para as medidas no RID estão na faixa de 7-10 µg/mL, os resultados do PAD estão na faixa de 1-8 ng/mL. Para glicose e arabinose a sensibilidade do PAD é cerca de 5000 vezes maior se comparado com o RID. A sensibilidade para sacarose é cerca de 1000 vezes maior.

Tabela 1: Limites de deteção (LD) calculados para a detecção amperométrica (PAD) e por índice de refração (RID).


Conclusão

Tanto a detecção PAD quando a detecção RID tem benefícios.

Com relação ao manuseio, a detecção RID é muito mais simples. A temperatura de separação não representa grande problema uma vez que o detector rapidamente se ajusta as condições de medida para esta coluna se sua célula de referência é rinsada suficientemente. Por sua vez a detecção amperométrica está um passo a frente e pode representar uma opção adequada para análises de carboidratos em baixas concentrações.

Portanto a detecção por índice de refração pode ser tranquilamente aplicada para medições na ordem de % ou mg/L em matérias primas e controle de fermentação enquanto a detecção amperométrica é a melhor opção para controles de perdas ou medições residuais em mg/L ou até µg/L.

Bibliografia

- VFD0183 – “Sensitivity boost – comparison of electrochemical detection and refractive index detection for sugar analysis” – www.knauer.net
- 8.014.5003 – “Monograph Ion Chromatography” – www.metrohm.com/pt-br

*Conteúdo patrocinado pela empresa Metrohm

 

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